Perché le spore continuano a tornare nel tuo cleanroom?

Introduzione

Un responsabile di microbiologia apre il report settimanale monitoraggio ambientale . Una piastra di contatto Grade C mostra una colonia di muffa. Due settimane prima, un isolato di Bacillus era emerso nella stessa stanza.

Il team ha pulito. Il team ha alternato i disinfettanti. La procedura è stata seguita. Quindi la domanda finisce sulla sua scrivania, ed è quella a cui risponde questo articolo: perché gli spore continuano a ritornare nella tua cleanroom?

La risposta onesta è che raramente è una sola causa. Sei problemi stanno dietro la maggior parte dei ritrovamenti ricorrenti di spore, e un settimo problema le nasconde alla vista. Ognuno è risolvibile con prove, e ognuno è qualcosa di cui un ispettore può chiedere.

Le spore sono fatte per sopravvivere

Gli endospore batterici sono dormienti ed estremamente resistenti al calore, alla disidratazione, alle radiazioni e ai prodotti chimici tossici. La loro durevolezza è strutturale, non accidentale.

La recensione di Peter Setlow su Journal of Applied Microbiology indica le principali difese. Le proteine del coat della spora probabilmente reagiscono e detossificano i prodotti chimici, la membrana interna è relativamente impermeabile e il DNA è protetto da piccole proteine solubili in acido.

La stessa recensione osserva che gli agenti ossidanti sembrano danneggiare la membrana interna della spora. Per questo le chimiche ossidanti come perossido di idrogeno e acido peracetico sono al centro della maggior parte delle scelte di agente sporicida.

Setlow e colleghi hanno anche mostrato che le spore prive di acido dipicolinico erano meno resistenti al hydrogen peroxide. Anche una singola molecola interna cambia quanto bene una spora resiste all'ossidazione.

I disinfettanti di routine non li raggiungono

La maggior parte della disinfezione delle cleanroom si basa su prodotti a largo spettro per l'uso quotidiano. Questi funzionano bene sulle forme vegetative dei batteri, ma gli alcoli non uccidono le spore batteriche. Per l'efficacia contro gli endospore è necessario uno sporicida.

Regolatori e compendi vanno tutti nella stessa direzione. La tabella sottostante riepiloga quanto dichiarano le fonti.

USP <1072> lo afferma chiaramente: "La rotazione di un disinfettante efficace con uno sporicida è incoraggiata".

C'è un però. Uno sporicida è intrinsecamente corrosivo, quindi generalmente non è raccomandato per l'uso quotidiano. Quello spazio tra la pulizia giornaliera e l'uso periodico dello sporicida è dove le spore possono riprendersi.

Le regole lasciano inoltre i dettagli aperti. Laura Brennan di Ecolab osserva che l'Appendice 1 non fornisce indicazioni su quante chimiche ruotare o con quale frequenza.

Lo sporicida è troppo raro o troppo debole

La frequenza è un compromesso. L'uso settimanale offre maggiore garanzia contro i formatori di spore e le muffe, ma può causare corrosione nel tempo a seconda della chimica.

L'uso trimestrale può essere adatto a siti con vincoli chimici o di salute e sicurezza, come la necessità di respiratori. Questo approccio può sembrare reattivo anziché proattivo, e serve una solida giustificazione se un sito riduce la frequenza in seguito.

Dose e tempo di contatto contano tanto quanto la frequenza. Uno studio dell'Università del Cairo ha testato un agente a base di acido perossiacetico e perossido di idrogeno su vinile. Al 2% è stato significativamente efficace dopo 5 minuti contro Aspergillus brasiliensis e dopo 10 minuti contro Bacillus subtilis.

All'1%, lo stesso agente non ha raggiunto nemmeno una riduzione logaritmica dopo 20 minuti. Un errore di diluizione può trasformare uno sporicida validato in un placebo.

La chimica e la superficie giocano anch'esse un ruolo. Uno studio EPA statunitense ha testato sei liquidi sporicidi su nove materiali. Prodotti a base di perossido di idrogeno e acido peracetico hanno dato le migliori prestazioni, seguiti dalle chimiche a base di acido ipocloroso, e i risultati variavano in base al materiale.

Residui, sporco e tecnica proteggono silenziosamente le spore

Uno sporicida funziona solo se entra in contatto con la spora. I residui o lo sporco possono agire come barriera fisica che impedisce ai disinfettanti di raggiungere le cellule microbiche.

L'Appendice 1 quindi si aspetta che la pulizia sia validata in modo da rimuovere i residui o i detriti che comprometterebbero l'efficacia del disinfettante. La rimozione dei residui è parte del controllo delle spore, non un compito separato.

La pratica industriale si sta muovendo in questa direzione. Nel sondaggio PDA del 2020, 170 intervistati (67%) avevano una procedura per rimuovere l'accumulo di residui. Nel sondaggio del 1997, 13 (50%) dichiararono di risciacquare le aree per rimuovere i residui.

La tecnica completa il quadro. I commenti del settore sull'Appendice 1 elencano la tecnica operatore incoerente fra le sfide comuni, osservando che anche agenti validati falliscono se la pulizia non garantisce una copertura adeguata. L'accumulo di residui è segnalato come un problema particolare in isolatori ad alto utilizzo dove gli sporicidi sono applicati frequentemente.

La pulizia conta solo se puoi dimostrare che funziona. Scopri come validare la tua per gli ispettori.

Leggi: Pulizia e sanificazione - Dimostrare che funziona nelle cleanroom farmaceutiche

Nuove spore continuano ad arrivare

A volte le spore non sono sopravvissute; sono di nuova entrata. Un articolo ISPE elenca eventi che possono giustificare trattamenti sporicidi aggiuntivi:

1. Costruzione della struttura

2. Attività di manutenzione

3. Spegimenti prolungati

4. Recupero di muffa

5. Tendenze microbiologiche avverse

Il flusso dei materiali conta anche. Il commento dell'Appendice 1 osserva che i trasferimenti da aree controllate non classificate in Grade C possono sostenere l'uso di sporicidi, a seconda del bioburden in ingresso e della valutazione dei rischi per la qualità.

Monitoraggio ambientale dovrebbe collegarsi all'azione. Se i formatori di spore vengono recuperati con costanza in Grade C, la contamination control strategy dovrebbe dettare un uso più frequente di sporicidi o un'indagine sui punti di ingresso.

Il piano di rotazione si basa sull'abitudine, non sui dati

Qui è dove molti programmi falliscono silenziosamente. La rotazione dei disinfettanti era storicamente giustificata dalla paura della resistenza microbica. Il pensiero attuale è più sfumato.

Un articolo ISPE spiega che la vera resistenza nelle camere bianche è generalmente considerata improbabile. I disinfettanti agiscono su più bersagli cellulari e sono applicati a concentrazioni ben al di sopra dei livelli minimi inibitori.

Scott Sutton, come riassunto in Cleanroom Technology, ha concluso che la selezione di mutanti resistenti ai livelli di disinfettante in uso non è stata dimostrata in ambienti di cleanroom. L'argomento più valido a favore della rotazione è spettro di attività, con un prodotto ad ampio spettro per gli organismi vegetativi e uno sporicida per i formatori di spore.

Come appaiono le pratiche

La PDA Letter ha confrontato un sondaggio del 1997 con un sondaggio webinar STERIS del 2020. I due hanno utilizzato definizioni diverse di rotazione, quindi i numeri non sono confrontabili direttamente.

Il sondaggio del 2020 ha anche chiesto cosa determina la frequenza di pulizia e disinfezione.

Solo circa la metà dei rispondenti ha collegato la rotazione ai propri dati. Il resto ha seguito linee guida specifiche o nazionali, il che suggerisce che le linee guida non sono allineate su quanti disinfettanti dovrebbero accompagnare uno sporicida.

Serve davvero tre prodotti?

Brennan ha esaminato i dati di monitoraggio in-situ di quattro siti di produzione consolidati. La sua conclusione è stata che ruotare due disinfettanti ad ampio spettro con uno sporicida non migliora necessariamente il controllo ambientale rispetto a un solo prodotto ad ampio spettro più uno sporicida.

Questo supporta un approccio basato sul rischio. Un'analisi microbica formale del rischio, una revisione periodica di EM e audit delle procedure dovrebbero determinare il numero di agenti e la frequenza, non una regola arbitraria.

Si applicano due cautele. I dati provenivano da quattro siti, e l'autrice ha dichiarato che sarebbe seguita una pubblicazione peer-reviewed. Consideralo un forte segnale, quindi confermalo con i tuoi dati.

Un trial in campo vale tanto quanto i dati di monitoraggio a cui lo colleghi. Vedi come scegliere i punti di campionamento, impostare le frequenze per grado e costruire mappe EM che mostrino se lo sporicida funziona davvero.
Leggi: Progettazione di un programma EM – sedi, frequenza e mappe nell’industria della microbiologia farmaceutica

Lo studio di efficacia non ha mai corrisposto alla vita reale

Il settimo problema nasconde gli altri sei. Un programma può sembrare convalidato sulla carta mentre le spore continuano a ricomparire sul pavimento. Tim Sandle descrive la qualificazione in tre fasi, che sono test in sospensione, test su superficie e trial in campo. I primi due sono descritti nelle norme, ma nessuna norma descrive il trial in campo.

Gli obiettivi di laboratorio variano a seconda del documento

Studi di efficacia dei disinfettanti si basano sul riduzione logaritmica un agente può raggiungere. Gli obiettivi accettati variano.

Non esistono requisiti compendiali o armonizzati di riduzione in log per i produttori farmaceutici. I siti dovrebbero definire gli obiettivi in base alle loro attività e ai dati storici di EM, e i criteri USP <1072> sono spesso i più adatti.

La metodologia EN 13697 viene frequentemente adattata con superfici aggiuntive, organismi specifici dell’impianto e livelli di inoculo inferiori. ASTM E2967 simula la pulizia con un dispositivo, sebbene il suo ambito microbico limitato possa limitarne l'uso nelle cleanroom farmaceutiche.

Dei rispondenti del 2020, 154 (63%) hanno qualificato i disinfettanti con organismi di riferimento e 68 (28%) hanno usato dati del fornitore. I dati del fornitore sono accettabili solo quando i coupon testati rappresentano le superfici della propria cleanroom.

Cosa mostrano i test sporicidi peer‑reviewed

Il metodo quantitativo Three Step Method è stato adottato come AOAC Official Method 2008.05 nel maggio 2008. Il suo studio collaborativo ha testato ipoclorito di sodio, una combinazione di acido peracetico e perossido di idrogeno, e glutaraldeide contro B. subtilis spore su vetro. I dati di 8 dei 10 laboratori partecipanti sono stati utilizzati nell’analisi finale.

La densità media di controllo era di 6,86 spore per portante su 72 test. In uno studio successivo, le densità di controllo variavano da 6,63 log su legno a 7,14 log su acciaio, quindi la superficie influisce su ciò che si recupera.

Perché i dati di laboratorio da soli non sono sufficienti

Le sfide di laboratorio utilizzano conteggi molto più elevati rispetto a una vera cleanroom. L'EPA spesso richiede riduzioni di 5–6 log in circa 10 minuti di tempo di contatto, mentre le popolazioni in cleanroom sono molto più basse e distribuite casualmente.

Il prova sul campo colma questa lacuna. Testa i disinfettanti nel punto d'uso e collega l'efficacia ai dati di monitoraggio ambientale. Può anche stabilire con quale frequenza disinfettare, con quale frequenza ruotare e se è necessario rimuovere i residui.

Un field trial in azione

Il case study di Sandle ha riguardato locali Grade B, C e D. Ogni locale ha utilizzato 4 settimane di un prodotto a base di ammonio quaternario a basso residuo seguite da 1 settimana di un prodotto sporicida a base di perossido di idrogeno, ripetute per tre cicli in 15 settimane.

Sono state prelevate sei piastre a contatto per locale prima e dopo la disinfezione programmata, con neutralizzante nell'agar.

Fonte: Sandle, Cleanroom Technology, 2021.

Questa è la risposta alla domanda iniziale in miniatura. Bacillus e Aspergillus sono stati recuperati all'inizio dello studio ma non si sono mantenuti, e non sono stati trovati ceppi resistenti dopo la disinfezione. Lo sporicida in rotazione stava facendo il suo lavoro.

Nota i limiti. Lo studio ha utilizzato prodotti di un unico fornitore, piccoli conteggi di campioni e riduzioni percentuali nei conteggi, quindi illustra più un metodo che non prova un risultato.

Domande frequenti

1. Perché le spore continuano a ricomparire nelle camere bianche?

Di solito si sovrappongono diverse cause. Le spore resistono ai prodotti chimici per natura, gli alcoli non le uccidono, e gli sporicidi possono essere usati troppo raramente o alla dose sbagliata. Residui, lavori di costruzione e trasferimenti peggiorano il problema.

2. Un agente sporicida è obbligatorio in un programma di disinfezione della cleanroom?

L'Appendice 1 afferma che la disinfezione dovrebbe includere l'uso periodico di un agente sporicida. USP <1072> incoraggia la rotazione di uno sporicida con un disinfettante. La frequenza dovrebbe derivare dalla vostra valutazione del rischio e dai dati EM.

3. Quanto spesso dovrebbe essere usato uno sporicida?

USP <1072> suggerisce un uso settimanale o mensile insieme a un disinfettante battericida giornaliero. I siti usano intervalli da settimanali a trimestrali, ciascuno con compromessi in corrosione, sicurezza e garanzia.

4. È necessaria la rotazione dei disinfettanti per prevenire la resistenza?

Commentari pubblicati affermano che non è stata dimostrata la resistenza ai livelli di disinfettante in uso nelle cleanroom. La rotazione è meglio giustificata per coprire uno spettro più ampio di organismi, incluse le spore.

5. Quale riduzione logaritmica dovrebbe dimostrare uno studio di efficacia di un disinfettante?

Non esiste un requisito armonizzato. EN 13697 usa più di 3 log per i formatori di spore, USP <1072> usa più di 2 log, e PDA TR 70 usa più di 1 log. Definite la vostra usando le vostre attività e la storia EM.

Riferimenti

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8. ISPE. Cosa rende efficace un programma di disinfezione della cleanroom? https://ispe.org/pharmaceutical-engineering/ispeak/what-makes-cleanroom-disinfection-program-effective

9. El Azab W. L'evoluzione delle pratiche di pulizia e disinfezione in 20 anni. PDA Letter. https://www.pda.org/pda-letter-portal/home/full-article/the-evolution-of-cleaning-and-disinfection-practices-over-20-years

10. Cleanroom Technology. Come progettare il programma di disinfezione per la vostra struttura farmaceutica. https://cleanroomtechnology.com/how-to-design-your-pharmaceutical-facility-disinfection-programme

11. Cleanroom Technology. EU GMP Annex 1: novità per pulizia e disinfezione. https://cleanroomtechnology.com/eu-gmp-annex-1-what-s-new-for-cleaning-and-disinfection-184850

12. Pharma Now. Programmi di pulizia e disinfezione secondo l'Allegato 1. https://www.pharmanow.live/microbiology-ccs/annex1-cleaning

13. Sandle T. Valutazione della rotazione dei disinfettanti nel punto d'uso: progettare uno studio sul campo. Cleanroom Technology. 17 Mar 2021. https://www.cleanroomtechnology.com/assessing-disinfection-rotation-at-the-point-of-use-designing-a-field-trial-175279

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16. Determinazione dell'efficacia degli sporicidi liquidi contro spore di Bacillus subtilis su una superficie dura non porosa utilizzando il Metodo Quantitativo in Tre Fasi: studio collaborativo. J AOAC Int. https://read.qxmd.com/read/18727544/determining-the-efficacy-of-liquid-sporicides-against-spores-of-bacillus-subtilis-on-a-hard-nonporous-surface-using-the-quantitative-three-step-method-collaborative-study

17. Wood JP, et al. Efficacia dei decontaminanti liquidi a spruzzo per l'inattivazione di Bacillus anthracis spore su materiali da costruzione e materiali esterni. 2011. https://agris.fao.org/search/ar/records/65de56370f3e94b9e5cdb541

18. Programma di pulizia e disinfezione parte dell'approccio del ciclo di vita: un approccio basato sul rischio piuttosto che arbitrariamente imposto. Teknoscienze. https://www.teknoscienze.com/tks_article/cleaning-and-disinfection-program-part-of-the-lifecycle-approach/